屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水的代谢熏染（二）

1.3.6 酶的屎肠定位及活性测定

1）粗酶液的制备

将屎肠球菌R2以3%接种量接种到黄浆水哺育基中，于37℃下静置哺育，球菌分说于12，发腐黄24，酵豆浆水36h取发酵液。谢熏发酵液于4℃下5000r/min离心10min，屎肠患上菌液上清及积淀；菌体积淀分心理盐水洗涤2次后，球菌悬浮于2mL、发腐黄pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，酵豆浆水于冰浴条件下妨碍超声破碎，谢熏超声功率130W，屎肠破碎光阴15min，球菌距离光阴2s。发腐黄破碎后于4℃、酵豆浆水12000r/min下离心10min，谢熏患上菌体碎片以及破碎上清；菌体碎片用5mL、pH=5.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤2次后溶于1mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液中用作酶活测定，菌液上清、破碎上清直接妨碍酶活测定。

2）绘制尺度曲线

精确称取0.1391g对于硝基苯酚，精确到0.001g，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，4℃下保存备用。挨次移取对于硝基苯酚尺度蕴藏液1，2，3，4，5，7，9mL，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，配成浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.7，0.9妹妹ol/L的对于硝基苯酚尺度使命液。

罗致1mL对于硝基酚尺度溶液于试管中，退出1mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；比力的空缺试管中退出2mLpH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；在所有的试管中退出8mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，在400nm处测定吸光值。以对于硝基苯酚含量为X轴、吸光值为Y轴，绘制尺度曲线。尺度曲线方程为Y=1.642X+0.006，R²=0.999。

3）酶活测定

将粗酶液、10妹妹ol/L对于硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液以及10妹妹ol/L对于硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液分说于37℃水浴中预热10min。而后罗致0.4mL粗酶液于清洁的试管中，分说退出0.4mL对于硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷溶液或者10妹妹ol/L对于硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷溶液，破碎上清以及破碎积淀酶活测定以缓冲液替换粗酶液作为空缺比力，菌液上清酶活测定以加热使酶失活的上清液作为空缺比力，于37℃中水浴10min后，退出3.2mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡混匀，妨碍酶反映，待冷却至室温后，将反映液于400nm处测定吸光值。凭证尺度曲线回归方程合计样品中菌液上清、破碎上清以及破碎积淀中的α-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶去世气愿望。

酶去世气愿望单元界说：在37℃，pH5.0条件下，1min催化天生1nmol对于硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活单元（U）。

1.3.7 对于DPPH·翦灭能耐的测定

参考刘力的措施略有更正，取2.0mL0.05g/LDPPH无水乙醇溶液，退出2.0mL发酵液，摇匀，置于25℃水浴中避光反映30min后，于8000r/min下离心10min，时期留意避光。在517nm处测定吸光度值。蒸馏水作为比力，Ｔrolox作为尺度物资，绘制尺度曲线。尺度曲线方程Y=-0.0285X+0.8299，R²=0.9907，服从以μgＴrolox/mL展现。

1.4 数据处置

服从以平均值±尺度差展现。运用SPSS18.0软件对于服从妨碍统计合成（One-wayANOＶA），运用Duncan’smultiplerangetest措施妨碍清晰性合成，选取P＜0.05为清晰水平。接管OriginPro8.0软件绘图。

2 服从与合成

2.1 发酵历程中酸度的变更

豆腐黄浆水中含有小份子糖类、卵白质及一些生物活性物资，适于微生物的妨碍，pH值可能反映屎肠球菌R2发酵黄浆水后组成的游离H+以及有机酸的变更情景。图1为屎肠球菌R2发酵黄浆水历程中OD值以及pH的变更纪律。从图1中可能看出，屎肠球菌R2可能运用豆腐黄浆水中的小份子糖类妨碍，飞腾黄浆水的pH值。随着发酵光阴的缩短，菌体妨碍量逐渐削减，pH值逐渐着落，其中12～24h之间菌体妨碍最快，pH着落最清晰。

2.2 发酵处置对于豆腐黄浆水中低聚糖含量的影响

2为屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水历程中低聚糖含量的变更纪律。别致豆腐黄浆水中5种糖的含量为19418.22mg/L，其中水苏糖以及蔗糖含量较高，水苏糖含量占5种糖含量的58%，蔗糖含量占5种糖含量的30%，棉籽糖、葡萄糖以及果糖的含量相对于较低。在屎肠球菌R2发酵豆腐黄浆水的历程中，低聚糖含量均有差距水平的着落。发酵12h后，葡萄糖的含量快捷着落，运用率抵达43%，其次为棉籽糖以及果糖，运用率均为17%，水苏糖以及蔗糖的运用率较低，分说为4%以及3%；发酵24h后葡萄糖根基运用竣事，无奈检出。此时，果糖的运用率抵达68%，棉籽糖的运用率抵达22%，水苏糖以及蔗糖的运用率均为12%。表明屎肠球菌R2在发酵豆腐黄浆水时优先运用葡萄糖，其次为果糖以及棉籽糖；发酵36h后，果糖的含量简直不爆发变更（P＜0.05），蔗糖的运用率抵达31%，棉籽糖以及水苏糖的运用率分说为38%以及24%。因此，经由屎肠球菌R2的发酵熏染，可能实用地缓解棉籽糖以及水苏糖引起的胃胀气。

2.3 屎肠球菌R2α-半乳糖苷酶的定位及活性合成

棉籽糖以及水苏糖的代谢需要α-半乳糖苷酶，钻研表明，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）、干酪乳杆菌（Lact.casei）、植物乳杆菌（Lactplantarum）、发酵乳杆菌（Lact.fermentum）、短乳杆菌（Lact.sbrevis）、布氏乳杆菌（Lact.buchneri）、肠膜明串株菌（Leuconostocmesenteroides）以及罗伊氏乳杆菌（Lact.reuteri）等在发酵的历程中可能渗透α-半乳糖酶，将α-半乳糖苷类寡糖水解为可消化的糖类。屎肠球菌R2差距部位的α-半乳糖苷酶酶活见图3。如图3所示，菌液上清酶活简直为零，剖析α-半乳糖苷酶不被渗透到细胞外，屎肠球菌R2的α-半乳糖苷酶不是胞外酶；细胞破碎并离心后，细胞破碎上清以及破碎积淀均具备酶活，剖析屎肠球菌R2的α-半乳糖苷酶属于胞内酶；细胞破碎积淀酶活清晰高于破碎上清酶活，剖析该酶以可溶性卵白以及不可溶性卵白两种方式存在，且主要以不可溶性卵白方式为主。这一服从与Ames等的钻研不同，其钻研表明大少数α-半乳糖苷酶位于G+阴性菌细胞质中。Mital等钻研证实乳酸菌所发生的α-半乳糖苷酶类的活性规模在pH4.5～8.0，而屎肠球菌R2发酵36h后pH着落到3.58（图1），严正偏离了该酶的最适pH，这导致了豆腐黄浆水中棉籽糖以及水苏糖被部份分解（图2），而不是被全副降解，这一服从与付亭亭等的钻研不同。

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